分子生物学细胞生物学实验实战技巧

　　在研发抗体展示平台的过程中，特别是在与学生一起工作的过程中，著者深刻体会到实验技巧对实验成功的重要性。许多时候，实验进展缓慢并不是因为实验设计或实验思路不对，而是因为实验方法不对、实验技巧欠缺或实验结果的分析方法不对。这不但影响研发的进展，也影响学生和科研新手的科研兴趣，甚至可能影响职业选择和职业发展。为解决这个困难，作者撰写了该书。

　　周辰，1978年广州第一军医大学军医系毕业。1983年西安第四军医大学，生物化学专业硕士。1995年西安第四军医大学，分子生物学专业博士。曾任美国南加州大学附属儿童医院免疫和骨髓移植系研究员、美国加州圣地亚哥Immusol生物公司高级研究员、南方医科大学客座教授/特聘教授，双展生物（贺州）科技有限公司联合创始人、总经理。细胞周期与基因表达调控、抗艾滋病基因治疗药物的研发、抗血栓抗体新药的研发等方面取得显著进展，发表论文22篇、出版著作3部，获得专利3项。 杨于军，1974-1978：南方医科大学（第一军医大学）医学博士，1989-1992：美国南加州大学附属儿童医院血液-肿瘤系博士后。先后任美国南加州大学附属儿童医院血液-肿瘤系博士后研究员、美国南加州大学附属儿童医院免疫和血液肿瘤系研究专员-III、实验室经理，美国斯坦福大学儿童医院儿科系造血干细胞血液-骨髓移植系生命科学研究专员，泷搌（上海）生物科技有限公司研发部高级经理。

目?? 录

引言 001
第一章?? 建立哺乳动物细胞表面抗体展示技术平台 002
第一节?? 多样化的抗体筛选技术 002
一、杂交瘤技术 004
二、B 淋巴细胞单克隆技术 005
三、细胞表面抗体展示技术 005
四、哺乳动物细胞表面全长抗体展示技术 006
第二节?? 全长抗体在哺乳动物细胞表面的展示和分析 008
一、单基因表达系统的选择 008
二、分泌型全长抗体的表达和分析 009
三、展示型全长抗体的表达和分析 012
四、抗原与展示型抗体的结合具有剂量依赖性 026
第三节?? 同步表达展示型和分泌型抗体 028
一、FCS（Furin 切割序列） 028
二、表达载体的设计和构建 029
三、抗体表达细胞 030
四、展示型抗体的分析 032
五、分泌型抗体的分析 033
第二章?? 哺乳动物细胞表面抗体展示技术平台的应用 038
第一节?? 筛选抗原特异性抗体 038
第二节?? 分析不同抗体的表达强度 040
一、抗体的选择 040
二、具体的实验和分析过程 040
第三节?? 筛选高亲和力抗体 045
第四节?? 分析鉴定中和抗体 054
第三章?? 应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术优化抗体亲和力 058
第一节?? 随机突变展示型抗体基因库的构建及分析 058
一、抗体及突变位点的选择 058
二、突变方案及引物设计 060
三、抗体基因库的构建及分析 060
第二节?? 细胞水平抗体库的构建及高中和活性抗体的筛选 063
一、细胞库的构建及分析 063
二、阳性抗体克隆的分选与分析 064
三、阳性抗体突变位点氨基酸的变化与中和活性的提高 065
第四章?? 展示型全长人源一级抗体库的构建及分析 067
第一节?? 表达载体的构建 068
一、启动子的选择 068
二、限制性内切酶的选择 068
第二节?? 抗体基因库的扩增 078
一、基本思路 078
二、设计合成扩增引物 080
三、外周血淋巴细胞总 RNA 提取 084
四、基因库 cDNA 第一链的合成 085
第三节?? 抗体库的常规构建 091
第四节?? 抗体库的快速构建 100
人源抗体重链可变区和全长轻链基因扩增引物的分组 100
第五章?? 定向快速高效多片段分子克隆与二级抗体库的构建 114
第一节?? 需求与可行性 114
第二节?? 双表达载体的设计与构建 116
一、双表达载体需要的功能组分 116
二、双表达载体的设计 117
三、引物的设计及 DNA 片段的 PCR 合成 118
四、4 片段定向连接构建双表达载体 119
五、分析双表达载体的抗体表达功能 120
六、4 个片段的自我连接与定向连接分析 121
七、4 片段定向连接效率分析 123
第三节?? 用 4 片段定向连接快速高效构建二级抗体库 124
第六章?? 乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体的筛选 126
第一节?? 从抗体库筛选特异性抗体的思路 126
一、一级抗体库的特点及筛选难度 126
二、二级抗体库与定点整合系统的局限性 127
三、从细胞展示抗体库中筛选特异性抗体的设想 128
四、从定点整合二级免疫抗体库开始是一个可行的方案 129
第二节?? 乙型肝炎特异性一级库的构建及分析 129
一、为什么选择筛选乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体 129
二、PBMC 的需求及总 RNA 的提取 131
三、一级抗体库的库容及质量分析 131
第三节?? 双表达定点整合乙型肝炎特异性抗体库的构建及分析 134
一、载体水平定点整合乙型肝炎特异性抗体库的库容及质量分析 134
二、定点整合抗体稳定表达细胞库的构建及质量分析 136
三、稳定表达细胞库的质量分析及保存 137
第四节?? 乙型肝炎表面抗原特异性抗体的筛选与鉴定 139
一、抗原的确定和处理 139
二、表达抗 HBsAg 抗体细胞的富集 143
三、表达抗 HBsAg 抗体单细胞克隆的分析鉴定 146
第七章?? 实战技巧专题讨论 153
第一节?? 分子生物学研究实验材料的特点及操作技巧 153
一、DNA 与 PCR 154
二、RNA 与基因克隆 158
三、蛋白质的稳定性及其变性 160
四、几种特殊情况下的实用技巧 161
第二节?? 影响小提 RNA 质量和产量的因素 167
一、RNA 酶与 RNA 的质量产量 167
二、总 RNA 小提技巧 171
第三节?? 质粒 DNA 的提取与鉴定 174
一、影响小提质粒 DNA 产量质量的因素 174
二、质粒 DNA 小提技巧 179
三、阳性细菌克隆的筛选 184
四、质粒 DNA 中提实例 190
第四节?? 琼脂糖凝胶电泳操作技巧 200
一、DNA 琼脂糖凝胶电泳的考虑因素 201
二、DNA 琼脂糖凝胶电泳操作技巧 205
三、实例分析：用一块凝胶同步分析从 0.5kb 到 10kb 的 DNA 片段 216
第五节?? 抗体库的构建与分析 218
一、构建大容量抗体基因库需要考虑的因素 219
二、抗体库轻重链的配对分析与保存 229
三、抗体稳定表达细胞库的构建、染色、分析和分选 233
第六节?? 细胞生物学研究实验材料的特点及操作技巧 237
一、细胞的培养与传代 238
二、细胞的冻存与复苏 242
参考文献 246