脂肪酸脱饱和酶的表达纯化及其功能活性研究

　　《脂肪酸脱饱和酶的表达纯化及其功能活性研究》设计克隆ω3脂肪酸去饱和酶-Δ17去饱和酶（Δ17FAD）基因，研究分析Δ17FAD及去掉跨膜结构的Δ17FAD（NT）基因对表达效率及酶活的影响，探讨基因的辅助区结构改变对酶——底物特异性及功能变化的机制。通过甲醇诱导实现在毕赤酵母表达系统中有效表达，纯化获取ω3脂肪酸去饱和酶，为商业化生产新型、高价值的重要脂肪酸提供科学依据，也为研究ω3膜蛋白的高级结构奠定重要基础。近年来的研究也表明，部分多不饱和脂肪酸及其代谢产物对内皮细胞有保护作用，这为内皮细胞损伤保护提供了研究方向。而氧化低密度脂蛋白可诱导内皮细胞凋亡并加速动脉粥样硬化的发生发展，导致了动脉粥样硬化后期的斑块破裂。内皮细胞的损伤及凋亡意味着内皮功能的紊乱，减缓内皮细胞损伤及维持内皮细胞功能正常，增强其对有害因子的抵抗力和耐受性，对动脉粥样硬化的防治非常关键。因此，《脂肪酸脱饱和酶的表达纯化及其功能活性研究》通过在血管内皮细胞中过表达低等生物的ω3去饱和酶基因比如Δ17（ω3）脂肪酸去饱和酶基因，将细胞内过多ω6多不饱和脂肪酸或者饱和脂肪酸催化转化为相应的ω3多不饱和脂肪酸，引导ω6/ω3多不饱和脂肪酸比例的平衡，从而探讨脂肪酸脱饱和酶的抗氧化作用及其对损伤细胞的修复作用，为防治心血管疾病如动脉粥样硬化的发生奠定理论基础。

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前言
第一章 绪论
第一节 多不饱和脂肪酸的概述
一、多不饱和脂肪酸简介
二、多不饱和脂肪酸来源
三、多不饱和脂肪酸的生物合成途径
四、ω3多不饱和脂肪酸功能性
第二节 脂肪酸合成的关键酶——脂肪酸去饱和酶的概述
一、脂肪酸去饱和酶分类及结构
二、ω3脂肪酸去饱和酶基因
三、ω3脂肪酸去饱和酶的研究进展
第三节 血管内皮细胞的概述
一、内皮细胞与动脉粥样硬化
二、血管内皮细胞生理功能
三、血管内皮损伤机制
四、内皮细胞损伤检测标志物
五、保护内皮细胞的因素
第二章 Δ17脂肪酸去饱和酶的克隆及表达
第一节 研究材料与方法概论
一、材料
二、实验方法
第二节 Δ17脂肪酸去饱和酶全长基因及无跨膜结构基因的克隆及表达
一、Δ17FAD基因跨膜结构分析
二、脂肪酸去饱和酶Δ17FAD及Δ17FAD（NT）密码子优化及偏性分析
三、重组载体pPICZαA-Δ17FAD及pPICZαA-Δ17FAD（NT）的构建
四、重组载体pPICZαA-Δ17FAD及pPICZαA-Δ17FAD（NT）的酶切验证
五、毕赤酵母重组子的PCR鉴定
六、毕赤酵母重组蛋白表达鉴定
第三节 结果与讨论
第三章 基因结构改变对脂肪酸脱饱和酶功能活性影响
第一节 研究材料与方法概论
一、材料
二、实验方法
第二节 Δ17脂肪酸去饱和酶的纯化及功能验证
一、Δ17脂肪酸去饱和酶的纯化及质量检验
二、Δ17脂肪酸去饱和酶活性验证
第三节 结果与讨论
第四章 稳定表达脂肪酸去饱和酶的细胞株的构建及功能验证
第一节 研究材料与方法概论
一、材料
二、实验方法
第二节 稳定表达Δ17脂肪酸去饱和酶的HUVEC细胞株的构建及功能验证
一、慢病毒重组载体的构建及病毒颗粒滴度检验
二、慢病毒转染HUVEC细胞的荧光鉴定
三、Real-time PCR检测慢病毒感染效率
四、Δ17FAD表达对HUVEC细胞脂肪酸组成的影响
第三节 结果与讨论
一、稳定高表达Δ17FAD的载体的选择
二、过表达Δ17FAD在HUVEC细胞中功能验证
第五章 Δ17脂肪酸去饱和酶对HUVEC增殖凋亡及抗氧化应激的影响
第一节 研究材料与方法概论
一、材料
二、实验方法
第二节 Δ17脂肪酸去饱和酶对内皮细胞增殖凋亡及抗氧化应激的影响
一、Real-time PCR检测HUVEC细胞中Δ17FAD相对表达量
二、MTT检测细胞增殖
三、流式细胞仪检测HUVEC细胞凋亡
四、HUVEC细胞氧化应激指标检测
第三节 结果与讨论
一、Δ17FAD对HUVEC凋亡的影响
二、Δ17FAD对HUVEC抗氧化应激的影响
第六章 Δ17脂肪酸去饱和酶对损伤内皮细胞保护机制的探讨
第一节 研究材料与方法概论
一、材料
二、实验方法
第二节 Δ17脂肪酸去饱和酶对损伤内皮细胞保护机制的探讨
一、Δ17FAD对细胞分泌TNF-α、IL-6及ICAM-1水平的影响
二、Δ17FAD对血管舒张因子NO及内皮一氧化氮合酶eNOS的影响
三、Δ17FAD调控细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3的表达
第三节 结果与讨论
一、Δ17FAD通过调节炎症及黏附因子的表达来修复损伤HUVEC
二、Δ17FAD通过调控ENOS/NO通路修复损伤HUVEC
三、Δ17FAD通过调控凋亡相关蛋白来抑制HUVEC凋亡
参考文献