生物制药实用技术

　　《生物制药实用技术》共分十章，主要介绍近30多年来生物制药技术在癌症研究、阿尔茨海默病、帕金森病、自身免疫疾病、心脑血管疾病、人体器官移植及组织培养等领域的新进展。全书较翔实地介绍了原核细胞基因工程制药技术和真核细胞基因工程制药技术及重组基因工程菌的大规模发酵工艺和重组基因工程细胞的大规模培养工艺，同时介绍了基因重组蛋白的大规模纯化工艺技术及基因重组蛋白的去病毒工艺、冷冻干燥工艺和稳定性观察方法。《生物制药实用技术》还详细说明了基因重组蛋白类药品的结构分析鉴定方法和质量检测技术方法，以及基因重组蛋白药物的药效学试验、临床前安全试验（包括急性毒性试验、长期毒性试验、特殊毒性试验和基因重组蛋白质药物的药物动力学研究等）的技术方法。此外，《生物制药实用技术》也介绍了基因重组蛋白质药物的注册申报程序和要求，还介绍了生物技术药物的临床试验操作方法步骤和临床试验需要的研究者手册与知情同意书的写作方法等。《生物制药实用技术》对高等院校生命科学领域从事生物技术药物的研究者和药学院校的师生具有重要参考价值，《生物制药实用技术》的出版希望对他们有所帮助。

　　张正光

第一章绪论1 一、生物制药技术突飞猛进，生物制药产业不断涌现1 二、癌症研究取得新突破4 三、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中及脊椎外伤研究取得新进展7 四、自身免疫性疾病有了新的治疗途径7 五、人体器官移植进展迅速8 六、预防和治疗心脑血管疾病有了新手段8 七、预防和治疗病毒感染有了新希望9 第二章原核细胞基因工程制药技术11 第一节原核细胞基因工程药物研制技术简述11 一、基因工程药物11 二、原核细胞基因质粒表达载体的构建15 三、基因工程菌株的构建21 四、转化大肠杆菌（构建基因工程菌）21 第二节工程菌高密度发酵27 一、发酵罐的消毒灭菌27 二、接种培养发酵29 三、菌体收集29 四、菌体破碎29 第三节包含体复性33 一、包含体蛋白复性方法33 二、提高包含体蛋白的复性产率34 第三章真核细胞表达蛋白药物研制40 第一节目的基困的获得40 一、目的基因获得的途径40 二、基因扩增一—PCR技术41 第二节真核细胞常用表达载体42 一、pEGFP—N1载体的特点42 二、GFp42 三、克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中的表达43 第二节真核细胞转染的一般程序44 一、试剂准备44 二、操作步骤44 三、SHG—44细胞的转染45 四、G418筛选45 第四节载体构建步骤48 一、克隆构建48 二、载体的选择49 三、体外重组49 四、重组子的筛选49 五、克隆载体导入受体细胞52 第五节克隆载体转染哺乳动物细胞53 一、化学转染53 二、物理转染54 三、重组表达质粒的细胞转染55 第六节重组基因工程细胞的大规模培养59 一、重组基因工程细胞的大规模培养操作程序59 二、激流式生物反应器63 三、中空纤维生物反应器65 第四章基因重组蛋白的纯化67 第一节目标蛋白的粗纯化H67 一、离子交换色谱法67 二、疏水相互作用色谱69 三、亲和色谱70 四、融合蛋白的纯化72 五、反胶团萃取74 六、浊点萃取法75 七、硫酸接分级沉淀法（盐析法）79 八、且又水相萃取技术分离纯化蛋白质81 第二节目标蛋白精纯化87 一、凝肢色谱87 二、双水相高速逆流色谱法90 第二节目标蛋白大规模纯化94 一、重组人血清白蛋白（rHSA）的分离提纯94 二、Streamline扩张床纯化重组蛋白96 第四节目标蛋白去病毒工艺101 一、离子交换色谱去除病毒工艺101 二、凝肢色谱去除病毒工艺102 三、亲和色谱去除病毒工艺103 四、疏水相互作用色谱去病毒工艺103 五、去除灭活病毒的其他方法104 第五节重组蛋白冷冻干燥工艺109 一、冷冻干燥的意义109 二、蛋白质干的保护剂110 三、退火111 四、干燥 五、真空度112 六、冷冻干燥操作步骤112 第六节重组蛋白产品的稳定性观察113 一、观测样品114 二、观测条件114 三、测定项目115 四、观察时间116 五、运输稳定性研究116 六、结果的分析116 七、标示117 八、名词解释117 九、重组人尿激酶原稳定性观察117 第五章目标蛋白产晶质量检测121 第一节目标蛋白纯度和生物活性检测121 一、目标蛋白定量测定121 二、目标蛋白产品的纯度检测126 三、目标蛋白分子质量测定129 四、目标蛋白生物活性测定131 五、目标蛋白等电点测定132 第二节重组蛋白中宿主细胞残留物检测135 一、目标蛋白产品中宿主细胞蛋白残留量检测135 二、目标蛋白产品中宿主细胞残留DNA检测140 一、目标蛋白产品中牛血清蛋白残留量检测141 四、重组目标蛋白产品中热原值检测143 五、重组蛋白纯化工艺中可能产生的杂质检测147 六、基因重组蛋白药品报送国家食品药品检定研究院检验148 七、工程细胞株和细胞库的质量控制152 第六章重组蛋白的结构分析与鉴定158 第一节重组蛋白肽图分析158 一、重组人干扰素α1b的肤图分析158 二、液质联用分析重组人白细胞介素—11的肽图159 第二节重组蛋自糖基定位和糖链组成分析161 一、糖链的释放161 二、气相色谱法测定重组蛋白的糖链组成164 第三节重组蛋白氨基酸分析165 一、目标蛋白的水解165 二、目标蛋白的氨基酸分析168 第四节重组蛋白圆二色性光谱分析和紫外光谱分析183 一、圆二色谱分析原理183 二、圆二色性尤谱实验步骤185 三、试验结果185 四、蛋白质紫外吸收光谱测定186 第五节重组蛋白的免疫原检测187 一、材料与方法187 二、实验步骤187 三、聚丙烯眈滕凝肢的配制188 四、转膜189 五、凝肢图像分析190 第七章重组基因工程药物的药效学研究191 一、动物种属／模型的选择191 二、给药剂量的设置192 三、人源重组蛋白在实验动物体内的免疫原性193 四、毒代动力学研究194 五、重组人尿激酶尿的药效学试验196 六、rhPro—UK对猪冠状动腺血栓的溶栓作用198 第八章基因重组药物的临床前安全评价201 第一节基因重组药物急性毒性试验201 一、喝齿类动物单次给药的急性毒性试验201 二、非嗤齿类动物的急性毒性试验（近似致死，剂量试验）203 三、说明204 四、LD50的测定204 第二节重组蛋白药品的长期毒性试验206 一、实验动物207 二、实验动物饲养管理207 三、试验方法207 四、说明209 第二节基因重组药物的特殊毒性试验211 一、微核试验211 二、致突变试验214 三、致癌试验217 四、致畸试验218 第四节基因重组蛋自的一般药理学研究225 一、药理学所用的生物材料226 二、受试药物226 三、受试动物教226 四、给药剂量226 五、重组人尿激酶原的一般药理学研究226 第九章基因重组蛋白的药物动力学研究231 第一节药物动力学指导作用231 一、药物动力学隔室模型232 二、药物动力学参数232 三、药物动力学方程234 四、药物动力学尿药数据法进行药物动力学分析234 五、药物动力学以血药浓度法建立的药物动力学方程235 六、静脉滴垃和静脉注射联合用药236 七、药物动力学统计矩法237 第二节药物的吸收、分布、排泄240 一、药物的吸收240 二、药物动力学生物利用度和药物动力学模型判刑方法241 三、药物的组织分布243 四、药物的排泄243 五、药物与血浆蛋白的结合244 六、重组人尿激酶原（rhPro—UK）的药物动力学研究245 七、重组人尿激酶原的组织分布249 第十章基因重组生物药物的注册申报252 第一部分治疗用生物制品252 一、注册分类252 二、申报资料项目253 三、申报资料要求254 四、申报资料说明254 五、关于临床试验的说明258 六、进行Ⅱ、Ⅲ期临床试验的程序258 七、进口治疗用生物制品申报资料和要求259 第二部分预防用生物制品260 一、注册分类260 二、申报资料项目261 三、申报资料的说明262 四、关于临床试验的说明264 五、进口预防用生物制品申报资料和要求265 参考文献267 附录1研究者手册{以重组人尿激酶原为范本）273 一、新生物制品临床研究申请表273 二、中国食品药品检定研究院274 三、重组人尿型纤溶酶原激活剂（rhPro—UK）的药学、药理学、毒理学、药代动力学和药放学的临床前研究工作总结277 四、有关尿激酶原（Pro—UK）的国内外研究综述286 附录2知情同意书新生物药晶临床试验知情同意书的设计规范及范例289