就在红军部队为躲避国民党步步紧逼的进攻而开始长征的同时，日本军队也进一步加强了对东北的控制。截至1935年，日本人开始向华北地区进军。面对日本侵华力度的加大，国民党党内的一些将军试图劝说蒋介石抗日。然而，蒋介石固执己见，认为打击共产党比保卫国家不受日本侵略更为重要。这一分歧最后导致了1936年12月著名的“西安事变”，张学良将军发动了反对蒋介石的行动。张学良原本也是东北军阀，后来他在东北的地位被日本人取代，国民党政府安排他到新的作战基地西安负责围剿共产党。张学良对他所得到的新的任命非常不悦，他坚信日本才是当时中国最大的威胁。于是他策划、组织了对蒋介石的绑架，将蒋介石作为人质扣押了两个星期，直到蒋答应与共产党协商合作。共同抗日才将其释放。
与此同时，除了集中精力处理党内事务，和在长征中奋力求得生存并在延安开展党建工作外，毛泽东也一直密切注视着日本人的动向。他抓住一切机会写作并发表分析评论文章，谴责蒋介石背信弃义的行为。1935年到1936年间，毛泽东发表了一系列连续将“日本帝国主义”和“蒋介石的背叛”联系起来的文章和演讲。毛泽东认为，蒋介石是日本帝国主义“侵掠”中国的“清道夫”，“在中国的反动支柱”。通过将日本如此轻易叩开中国大门的责任推到蒋介石身上，毛泽东得以将他自己和他领导下的中国共产党置于抵抗日本的最前线。在发给张学良将军的电报中，毛泽东宣称，张学良扣押蒋介石不仅仅将国民党逼上了抗日的道路，而且还“驱逐了军队中的法西斯分子，向广大官兵昭示了蒋介石出卖国家、伤害人民的罪行” 。
毛泽东清晰地表达了希望蒋介石永远让出职权的愿望。但事态并未如此发展。与此相反，共产党不得不与蒋介石协商，以开展新一轮的两党合作。协商耗时八个月，最终实现了国共两党间的第二次合作。与第一次国共合作不同，这一次的合作保证了两党各自的独立性。周恩来作为组长带领共产党谈判小组赴国民党首都南京。毛泽东在写给周恩来的信中说道：“首要原则就是保证我们”对红军部队的“绝对领导权”；“原则是保证我党的独立性。在这些方面，我们绝不能妥协让步。”
1937年7月，日本军队以北平卢沟桥事变为借口，发起全面侵华战争。由于国民党军队的混乱无序，日本军队以风驰电掣般的速度从北平向中国南部地区行进。1937年11月，另一股日军攻占上海，那里的国民党军队虽然进行了英勇的抵抗，但这种防卫最终还是徒劳无功。日本军队长驱直入，直攻国民党政府首都南京，在那里他们犯下了滔天罪行，发起了侵华战争期间最臭名昭著的“南京大屠杀”。蒋介石命令国民党部队撤离南京，逃到内陆地区。于是，日本军队就进入了一座没有任何防守的城市。他们四处杀人放火，奸淫掳掠，暴力放荡的日本人将杀人当成消遣，残忍杀害数十万手无寸铁的中国人。这种惨无人道的行径，在随后日本占领中国长达八年的时间里，树立了残忍折磨中国人的行为模式。到20世纪30年代末，这种行为模式被简化为日本军队的官方教条“三光”政策：烧光、抢光、杀光。
鉴于形势的恶化，第二次统一战线的部署非常急促。毛泽东停止了对蒋介石的书面攻击，蒋介石也结束了国民党部队对延安的封锁。国共两党间的合作在1937年秋终于达成。这次国共合作维系了几年的时间，其间几经波折和反复磨合。毛泽东一直保持着对统一战线名义上的忠诚，即便是在20世纪40年代早期统一战线破裂之时。
