蒋介石下令放弃徐州后，即在武汉外围长江两岸积极部署兵团，阻止日军西进。此时，蒋介石吸取淞沪、南京会战的教训，改变了死守一城一地的战略。由蒋介石批准的《对武汉附近作战之意见》指出：
武汉已为我抗战之政治经济及资源之中枢，故其得失关系至巨。惟武汉三镇之不易守，而武汉近郊尤以江北方面之无险可守尽人皆知，更以中隔大江外杂湖沼，尤非久战之地，……故欲确保武汉而始终保持武汉为我政治经济资源之中枢，则应战于武汉之远方，守武汉而不战于武汉是为上策。〔49〕
本着“守武汉而不战于武汉”的作战宗旨，蒋介石对保卫武汉作了军事部署。
自6月12日日军攻陷安庆至10月25日武汉失守，蒋介石一直驻守武汉，亲自指挥。在此期间，蒋介石还不时召集高级将领，发表谈话，强调武汉保卫战的重要意义，鼓励将士们奋勇杀敌。在《保卫武汉的责任和要务》一文中，蒋介石强调说：
最重要的一点就是武汉现在已成了我们抗战革命最重要的根据地，也是全世界视听所集中之点；武汉如能固守，即是我们最后胜利的开始，武汉若有疏失，就要使抗战前途加重不知多少倍的困难。武汉的得失直接关系于整个抗战的胜败和国家民族的生死存亡，因此，我们一定要拼死固守，誓死保卫到底！〔50〕
战役期间，蒋介石还不时对外发表讲话，既表明中国政府保卫武汉的决心，也申明中国政府坚持长期抗战的决心和中日战争之持久性，“一城之得失，不会决定胜负”。在7月18日，蒋介石接见英国《每日先驱报》驻华记者史诺，回答史诺提出的问题时说：“武汉必能坚守，而日军后方，因中国游击部队日益活跃之故，则将变为前线。”又说：“纵令武汉将来有不能守之一日，殊亦无损于抗战之毫末；中国之目的固在长期作战以消耗敌人力量，而获得最后胜利，相信保卫武汉之战，必使敌人遭受重大损失也。”9月13日，蒋介石在汉口接见英国代办葛凌。葛向蒋探询中国在原则上可否同意在汉口设安全区，并面陈日本所提之苛刻条款。蒋介石予以坚决的回答说：“凡有中国军队驻守的地方就是安全区。”断然拒绝日方无理要求，并强调指出：“中国抗战是自卫，也为保卫国联盟约，英国既同为会员国，应彻底与中国合作，驱逐此人类公敌；此种无理条款，英国根本不应转递。”
10月24日，日军对武汉形成了东、北、南三面包围的态势。同时为策应武汉会战，日军于10月12日在广东南海大亚湾登陆。10月21日，广州失陷。广州失守使粤汉路的战略价值发生了变化。蒋介石在22日的日记中说：“此时武汉地位已失重要性，如勉强保持，则最后必失，不如决心自动放弃，保全若干力量，以为持久抗战与最后胜利之根基。”10月25日，日军开始进攻葛店，武汉附近发生激战。就在这一天，蒋介石离开武汉飞往湖南，国民党军队从武汉全部撤退。蒋介石命令：“将凡有可能被日军利用之虞的设施均予破坏。”武汉燃烧了两天，日军最终占领的只是一座空城。
武汉会战，中日双方均动用了开战以来的最大兵力，日军最终未能歼灭中国100多个师中的哪怕1个师，其原因在于蒋介石吸取了先前的教训，充分实施了“以空间争取时间的战略计划”。在武汉会战期间，蒋介石一方面鼓励将士们誓死保卫武汉，另一方面又根据会战的实际情况适时调整部署，及早安排撤退计划。鉴于上海的教训，国民政府早在1938年3月就开始拆迁汉阳铁厂。武汉会战开始后不久，蒋介石又下令疏散武汉人口。日军在大亚湾登陆后，蒋介石分别致电驻守长江南岸及卫戍武汉的第九战区司令长官陈诚和驻守长江南岸的第五战区司令长官李宗仁，令其在维持态势的情况下，适时部署转移计划。
