1937年卢沟桥事变后，北京大学撤离北平，他没有同行，成为4名“留平教授”之一（另外三位留守的教授是孟森、马裕藻、冯祖荀），受校长的委托看守校产。北大校长蒋梦麟后来在回忆录里谈到：“抗战的时候，他留在北平。我曾示意他说，你不要走，你跟日本人关系比较深，不走，可以保存这个学校的一些图书和设备。于是，他果然没有走，后来因他在抗战时期曾和日本人在文化上合作被捉起来关在南京。我常派人去看他，并送给他一些需用的东西和钱。记得有一次，他托朋友带了封信出来，说法庭要我的证据。他对法庭说，他留在北平并不是想做汉奸，是校长托他在那里照顾学校的。法庭问我有没有这件事？我曾回信证明确有其事。”
1939年元旦，一个自称是周作人学生的人求见，见面时突然拔枪向他射击。所幸子弹射中铜扣只造成轻伤，该刺客逃逸后始终未被捉获。有关枪击案的凶手是谁一直众说纷纭。周作人始终坚持是日本军方的阴谋，日方则说是国民党特务所为。
受伤的不仅是肉体，更是对心志的打击。周作人在遇刺后不久，就接受了汪精卫南京政府国立北京大学图书馆馆长的聘书，3月兼任北京大学文学院筹办员，开学后兼任文学院院长。
不久，1940年11月8日，汪精卫政权华北政务委员会教育总署督办汤尔和死于肺癌。12月19日，汪伪政府中央政治委员会第31次会议通过决议，特派周作人为华北政务委员会委员，并指定其为常务委员兼教育总署督办。至此，周作人身上算是正式烙下了跳进黄河也洗不掉的污点，成了一个遭人唾骂的“汉奸”。
抗战结束后，周作人在北京以汉奸罪名被国民政府逮捕，并押解南京受审，监禁于老虎桥监狱。他的朋友、学生纷纷为他开脱求情，俞平伯还给在美国办外交的胡适写了封长信，请求胡适为周说情。1946年11月6日，高等法院判处他14年有期徒刑，1947年12月9日改判10年有期徒刑。
1949年1月22日，李宗仁接任中华民国总统，为国共和谈而下令释放政治犯。周作人也在1月26日被释放出狱。
解放后，周作人搬回北京八道湾的老房子，专心翻译和写作，以稿费维持生计。他曾给周恩来写了一封6000多字的长信，为自己的过去作些解释。周恩来将这封信转呈毛泽东，毛批示道：“文化汉奸嘛，又没有杀人放火。现在懂希腊文的人不多了，养起来，做翻译工作，以后出版。”
1951年，周作人又直接上书毛泽东，为自己辩白。毛的秘书胡乔木给毛泽东的书面报告说：“周作人写了一封长信给你，辩白自己，要求不要没收他的房屋，不当他是汉奸。我的意见是：他应当彻底认错，像李季一样在报纸上悔过。他的房屋可另行解决（事实上北京地方法院也并未准备把他赶走）。他现已在翻译欧洲古典文学，领取稿费为生，以后仍可在这方面做些工作。周扬亦同此意。当否请示。”
毛泽东批曰：“照办。”自此，周作人专事翻译和写作，但因被剥夺政治权利，其着作不允许以本名出版。
文革开始后，周家即遭红卫兵查封，他本人也遭到皮带、木棍子毒打。不堪凌辱的耄耋老翁两次写信让儿媳张菼芳交给当地派出所，要求服用安眠药安乐而死，均无回音。1967年5月6日，周作人突然发病去世，享年82岁。
周作人曾有一个长达13字的署名：京兆布衣八道湾居士苦茶庵主。他还自称前身为和尚。可见“布衣”和“居士”是他生活的情趣和态度。但周作人并不是六根已净的人，“知我者谓我心忧，不知我者谓我何求”的忧惧心情，“中心摇摇”的心理状态，是八道湾居士茶苦的原因。古人云，诗言志，《苦茶庵打油诗》中很有几首可以值得玩味的。其中反映“布衣”情怀的，是他在1942年作的一首，原诗云：“野老生涯是种园，闲衔烟管立黄昏。豆花未落瓜生蔓，怅望山南大水云。”
