这时期，杰斐逊与财政部长亚历山大·汉密尔顿的关系还算融洽，甚至两人搞过一笔 交易 ：汉密尔顿的财政政策的要点之一是由联邦偿还州债，但在众议院受到了阻滞，于是求助于威望极高的杰斐逊。杰斐逊在未了解详情的情况下应允了，但提出了一个交换条件：汉密尔顿必须支持他的迁都计划（即把首都迁至弗吉尼亚的乔治敦）。最终，双方皆大欢喜。
杰斐逊主张迁都还有其更深层的设想：把首都从一座已经定型的、人口混杂的、具有市侩气的城市迁出，重新设计建造一座新城，以体现美利坚民族的精神风貌和美好未来。
在外交方面，起初杰斐逊与汉密尔顿的矛盾并不大，他们都赞同美国在外交方面实行中立化原则，只是在实施的具体方式上有不同的主张。
但是，因为杰斐逊与汉密尔顿在政治原则和国内外一系列重大问题上的观点截然不同，所以不久就分道扬镳了。汉密尔顿是个贵族政治论者，十分崇尚英国的政治体制，主张在美国实行君主立宪制；而杰斐逊则一向大力倡导民主政治，对君主制和世袭制抱厌恶的态度，反对等级特权。汉密尔顿奉行偿还公债政策，主张加强对英贸易，以维护大资产阶级的利益；杰斐逊则热爱土地和在土地上劳动的人民，要求国家保护农业利益，反对汉密尔顿的财政方案，主张广泛发展与各国的经济交往，改变严重依赖英国的殖民地经济。汉密尔顿厌恶法国革命，主张实行亲英外交；杰斐逊同情法国革命，但他从美国的实际利益出发，支持华盛顿的中立政策，以避免卷入欧洲的纷争。二人在诸多问题上产生的分歧和冲突，使华盛顿政府不时出现危机，并促进了党派精神的萌发，即使是华盛顿的权威和声望，也未能阻止政党政治的迅猛发展。
1791年夏天，杰斐逊和麦迪逊做了一次 植物考察旅行 ，在采集标本和观赏自然景观的同时，他们与纽约的共和主义者建立起了政治上的联盟，这是共和党形成过程中的关键一步。
虽然杰斐逊同情法国大革命，厌恶君主制，但在处理国际事务时还是相当务实理智的，总是设法使美国避免卷入欧洲的政治和战争，因此原则上支持1793年的《中立宣言》。他在这一问题上与汉密尔顿的区别在于：汉密尔顿要求废除美法同盟条约，而杰斐逊则主张回避这一问题。
1793年春，法国新公使埃德蒙·热内来美。杰斐逊热情地会见了这位来自革命法国的使者，同时告诫他应谨慎行事。但此人头脑狂热，企图利用人们对法国革命的热爱在美国掀起仇英情绪，使一贯同情法国的杰斐逊认识到 此人将会断送掉共和党 。于是他巧妙地使法国政府召回热内，从而化解了一场危机。
1792～1793年，汉密尔顿的反对者在麦迪逊的领导下组成了一个全国性的政党 共和党，由于杰斐逊的社会地位和政治影响，被公认为是该党派的精神领袖。1792年夏秋之交，汉密尔顿利用弗雷诺在《国民公报》上发表抨击他的文章的事件，对杰斐逊进行猛烈的人身攻击。杰斐逊曾举荐弗雷诺在国务院任译员，但他表示从未指使弗雷诺从事党派活动，而且拒绝压制弗雷诺。此时，杰斐逊对政治生活已感到厌倦，请求辞职，但被总统拒绝了。
1793年的最后一天，他的辞呈最终获批准，遂起程返乡。
副总统在蒙蒂赛洛，杰斐逊避开一切公务，全身心地经营他的农场，进行科学研究，并从书本和家庭生活中寻找乐趣。在退休后的两年中，他的农场生产已经达到了州内一流水平。但国内政治形势的发展仍不时牵动他的心。他对华盛顿政府日趋保守的倾向深感不满，认为《杰伊条约》是美国外交的 耻辱 ，指责汉密尔顿偏袒大资产阶级的利益，是一个贵族政治论者，反对政府的亲英外交政策。然而他一再发誓：永不踏入政坛。但由于他在民众和政坛中均拥有巨大的威望，1796年共和党仍推举他为总统候选人。虽然杰斐逊本人在选举中一直作壁上观，但结果仅以三票之差败给了约翰·亚当斯，成为亚当斯政府的副总统。据分析，只要杰斐逊稍做努力，选举就会是另一种结局。亚当斯的当选还得益于当时人们的一种模糊看法，即认为副总统理应继任总统之职。但杰斐逊却表现出一种开明和大度，他甚至表示：论资历，亚当斯当总统是应该的。
