周恩来还筹建了一支特种革命队伍——大元帅府铁甲车队。这实际上是中国共产党直接领导下的第一支革命军队。后来，这支队伍扩建成为国民革命军第四军独立团，成为北伐军的先锋。
1925年，革命军进行了两次东征，周恩来都是政治部的领导人。他规定了“不拉夫，不筹饷，不强占民房，不用军用券”等。东征军纪律严明，鸡犬不惊，当时曾有“莫走人家取门板，莫拆民房搬砖石，莫踏禾苗坏田产，莫打民间鸭和鸡”的《爱民歌》。“革命军所到之地，人民乐于贸易，自愿帮助运输并代做侦探工作，所以作战顺利，一战而克服东江，此乃中国军队第一次战时政治工作之成绩。”
在东征中，周恩来不仅取得了政治部工作的实践经验，而且有了军事指挥、后方勤务和地方行政工作的实践。
第一次东征中，他参加了进攻淡水之役。淡水是一个地势险要、易守难攻的城池，陈炯明部约4？000人守城。蒋介石、周恩来等听叶剑英汇报了敌情和作战方案，详细商定了攻城计划。2月13日发起攻击，周恩来和各级党代表鼓励学生军奋勇战斗，协同粤军第二师占领了淡水。第二次东征中，周恩来参与指挥了攻打惠州城的战役。在战争的关键时刻，他命令蒋先云组织以共产党员和共青团员为骨干的敢死队强行登城。惠州攻克，取得了这次东征的决定性胜利。接着，他又与何应钦率第一师攻占海丰，同陈炯明部近万人决战于华阳、河婆一带，全歼敌中路主力。陈炯明残部退入福建，东征军入闽追歼，周恩来留在汕头主持后方工作。东征胜利结束后，他受命行政主要职务。他帮助地方建立政党、政权和工会、农会等组织，扩大了军队的群众基础。
在两次东征之间，广州发生了著名的沙基惨案。6月23日，为了声援“五卅”后上海工人的斗争，从香港返回广州的罢工工人和广州的工人、农民、士兵、学生10万人游行示威，经过沙面租界对岸的沙基村时，遭到英、法等国的武装镇压，死50余人，重伤170多人。周恩来参加了群众游行队伍，3个人一排行进，机关枪扫射过来，他两边的人都中弹身亡，他得以幸免。这是他回国后领导群众斗争遇到的第一次险情。他总是勇于站在斗争的第一线。
1926年12月，周恩来离开广东到上海，任中共中央组织部秘书和中央军委委员，次年2月，任中共上海区委军委书记。
2月23日，中共中央、中共上海区委举行联席会议，决定成立特别委员会，由陈独秀、罗亦农、赵世炎、何松林（汪寿华）、尹宽、彭述之、周恩来、萧子璋组成，并决定成立以周恩来为首的特别军委，准备进行上海工人第三次武装起义。武装起义发动时，周恩来担任了总指挥。
北洋军阀驻在上海的，是毕庶澄部，约3？000人，加上当地警察共5？000人左右，兵力不强，军心不稳。这对于举行起义是有利的。陈独秀作为中共中央总书记、特委负责人，对于这次起义是积极的，对组织起义也提出过正确的意见。但是他不主张组织和训练工人的武装队伍。周恩来不同，他认为敌人部队对我们能起多大作用，这取决于我们对工人的武装程度，取决于工人拥有的力量。他重视“自己的准备”，“纠察队、自卫团都有规定特别工作”，“并加暴动起来夺取武装”。周恩来根据特别军委的讨论，提出了军事工作的纲领性计划，包括建立领导机构，组织武装力量，加强队伍训练，准备武器，搜集情报，并且加强敌军工作，核心是建立一支由中共直接领导的有战斗力的武装队伍，成为武装起义的主力。他们组织了纠察队2？300人，赤卫队800多人，特别队数百人。周恩来亲自到各训练地点作政治报告并进行军事训练。
